Kontakt:Errol Zhou (Gospodin.)
Tel: plus 86-551-65523315
Mobilni/WhatsApp: plus 86 17705606359
QQ:196299583
Skype:lucytoday@hotmail.com
Email:sales@homesunshinepharma.com
Dodati:1002, Huanmao Zgrada, br.105, Mengcheng Cesta, Hefei Grad, 230061, kina
Sažetak
Dijabetes je hronična i progresivna bolest s neprestano rastućom rasprostranjenošću, rastućim financijskim pritiskom na svjetske zdravstvene sustave. Nedavno je inzulinska rezistencija, zaštitni znak dijabetesa tipa 2, izlečena na miševima koji su tretirani NAD + prekursorom β-nikotinamid mononukleotidom (NMN) , a nisu prijavljeni toksični efekti. Međutim, NMN ima visoku cijenu, potrebne su ekonomičnije metode proizvodnje. Ovo istraživanje predlaže biotehnološku metodu proizvodnje NMN-a u Escherichia coli . Pokazujemo da bikrosronska ekspresija rekombinantne nikotinamid fosforibosil-transferaze (Nampt) i fosforibozil-pirofosfat (PRPP) sintetaza u prisustvu nikotinamida (NAM) i laktoze može biti uspešna strategija ekonomične proizvodnje NMN-a. Proteini ekspresije proteina koji nose NAMPT gen iz Haemophilus ducreyi i PRPP sintetazu iz Bacillus amyloliquefaciens sa mutacijom L135I transformisani su u Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Proizvodnja NMN dostigla je maksimalno 15,42 mg po L bakterijske kulture (ili 17,26 mg po gramu proteina) u tim ćelijama uzgojenim u mediju PYA8 uz dodatak 0,1% NAM i 1% laktoze.
Uvod
Prema Međunarodnoj federaciji za dijabetes, broj odraslih s dijabetesom tipa 2 u 2017. godini bio je 425 milijuna, a očekuje se da će dostići 649 milijuna do 2045. Na globalnoj razini troši se 12% proračuna za zdravstvo (ili 727 milijardi USD) o liječenju dijabetesa. Nedavne studije povezivale su otpornost na inzulin, zaštitni znak dijabetesa tipa 2, pad funkcije mitohondrija i smanjenje nivoa NAD + kao i odnos NAD + / NADH, također primijećeno u starenju. NAD + je prisutan u svim živim organizmima i dobro je poznat koenzim u oksidacijsko-redukcijskim reakcijama. NAD + ovisne proteinske deacetilaze poput SIRT1 i SIRT6 služe kao metabolički senzori i reguliraju nizvodne puteve, koji na kraju obnavljaju mitohondrijsku funkciju i osjetljivost na inzulin. Ovaj nalaz proširuje domenu istraživanja NAD + efekata na ostale degenerativne bolesti povezane sa starenjem, kao što su: kardiovaskularni, rak, artritis, osteoporoza ili Alzheimerova bolest.
Mononukleotid β-nikotinamida (NMN) intermedijar je u biosintezi NAD + proizvedenoj iz nikotinamida (NAM) i fosforibozil-pirofosfata (PRPP) enzimom nikotinamid fosforibosil-transferaze (Nampt) (EC 2.4.2.12). Dobro podnošljiv, bez prijavljenih nuspojava tijekom dugotrajne primjene na miševima i sprječavanja fiziološkog pada povezanog sa starenjem, NMN se pokazao efikasnim u liječenju dijabetesa tipa 2 izazvanog visokom masnoćom, preusmjeravanjem mitohondrijske disfunkcije povezane sa starenjem i spašavanjem. efekt propadanja neuronskih matičnih ćelija povezanih sa starenjem.
NAM se obično pretvara u NMN pomoću enzima koji su uključeni u NAD + puteve spašavanja, kao što je Nampt. Delovanje ovog enzima čini glavnu NAD + anaboličku aktivnost u ćeliji. Regulacija nukleotidnog metabolizma sisara ili mikroorganizama obično se odvija konzumiranjem PRPP. PRPP nastaje iz riboze-5-fosfata i putem oksidativnih i neoksidativnih grana na putu pentoznog fosfata.
U bakterijama NAM se najčešće pretvara u nikotinsku kiselinu (NA) pomoću nikotinamidaze koja je integrirana u put Preiss-Handler, a to je slučaj i sa Escherichia col . Kod sisara nije zabilježena aktivnost nikotinamidaze; Umjesto toga, NAM se pretvara u NMN pomoću jednog od NAM enzima fosforibozil-transferaze. Iako većini bakterija nedostaje NAM fosforibozil-transferaza, enzim je eksprimiran u Haemophilus ducreyi i Shewanella oneidensis .
Jednostavni i metabolički svestrani organizmi, poput Escherichia coli , često se koriste u biotehnologiji za kontroliranu ekspresiju proteina sa željenom enzimskom aktivnošću. DNA kodiranje takvih enzima često se unosi u bakterije ekspresijskim vektorima kao što je pET sistem iz Novagena. PET vektori se transformišu u bakterije koje eksprimiraju T7 RNA polimerazu, poput E. coli BL21 (DE3). Kontrola ekspresije enzima postiže se upotrebom lakog promotora, koji se ekspresijom uključuje samo u prisustvu laktoze (koja se metabolizira i kao izvor ugljika) ili njezinog sintetičkog strukturnog analoga, izopropil-1-tio-β-D-galaktopiranozida (IPTG) ( ne metabolizira se, sa konstantnom koncentracijom tokom procesa rasta). Kako je metabolizam bakterija svestran, varijacija izvora ugljika i koncentracija supstrata enzima sa srednjim dodavanjem su ključni faktori koje treba uzeti u obzir u biotehnološkom procesu.
U namjeri da riješimo trenutni problem visokih cijena NMN-a , u našem prethodnom radu predložili smo metodu pročišćavanja iz bakterijskih ćelija. Za daljnju optimizaciju procesa, kako smo uspjeli pronaći samo jednu metodu proizvodnje kvasca, ovo istraživanje predlaže jednostavnu i isplativu metodu biotehnološke proizvodnje NMN u Escherichia coli .
Rezultati
Bakterijska transformacija
Višestruko poravnavanje nizova aminokiselina generirano za pretpostavljeni NadV iz Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 i Nampt iz Mus musculus , pokazuje veliku sličnost (Sl. S1), što sve ove enzime čini kandidatima za biotehnološki proces.
Transformirani E. ćelije coli sa nadV (NAMPT) genima koje nose pET28a (+) plazmidi formirali su kolonije na LB Agar pločama dopunjenim kanamicinom. Nisu otkrivene kolonije na pločama inokuliranim netransformisanim bakterijskim ćelijama. Agaroza gel elektroforeza plazmidne DNA izolirana iz ovih kolonija potvrdila je prisustvo Nampt-PET28a, pET28a-soNadV ili pET28a-hdNadV plazmida u E. coli DH5α (dopunska Sl. S2A, traka 2, 3, 4). DNK trake odgovaraju granicama od E. coli BL21 (DE3) pLysS ćelije (dopunska slika S2A, traka 6, 7, 8), koje su transformisane odgovarajućim plazmidima izdvojenim direktno iz E. coli DH5α. U netransformisanom E. coli BL21 (DE3) pLysS ćelije, korištene kao negativna kontrola, prisustvo pLysS plazmida potvrđeno je elektroforezom, bend koji odgovara poznatoj dužini od 4886 bp (dopunski Sl. A, linija 5) prikazan je na agaroznom gelu.
(Za više eksperimentalnih podataka, pogledajte izvornu web stranicu: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)